Aluminium triisopropanolate

Genetic toxicity: in vitro

Administrative data

Endpoint:

in vitro DNA damage and/or repair study

Remarks:

Comet assay

Type of information:

experimental study

Adequacy of study:

key study

Study period:

2008

Reliability:

2 (reliable with restrictions)

Rationale for reliability incl. deficiencies:

guideline study without detailed documentation

Data source

Reference

Reference Type:

publication

Title:

Unnamed

Year:

2008

Report date:

2007

Materials and methods

Test guideline

Qualifier:

no guideline available

Principles of method if other than guideline:

Le test Comet dépend de la capacité des fragments d'ADN chargés négativement à subir une électrophorèse dans un gel d'agarose. La mesure dans laquelle l'ADN migre est directement liée à la quantité de dommages à l'ADN. Une suspension de cellules est mélangée avec de l'agarose à bas point de fusion, étalée sur une lame et lysée. L'ADN est ensuite déroulé et subit une électrophorèse à un pH particulier. Le pH utilisé dicte les types de dommages à l'ADN détectés. Par exemple, un pH neutre (7-8), utilisé dans cette étude, détecte principalement les cassures double brin et les liaisons transversales, tandis qu'un pH supérieur à 13 permet la détection de cassures simple brin, de sites de réparation d'excision incomplets et de sites labiles alcalins. en plus des lésions détectées à pH neutre. Sous l'influence d'un champ électrique, l'ADN endommagé migre vers l'anode en produisant une forme de comète. La quantité de migration et la forme de la comète sont un indice des dommages à l'ADN qui peuvent ensuite être analysés au microscope ou avec un logiciel d'analyse d'image.

GLP compliance:

not specified

Remarks:

Étude issue d’une publication faite en laboratoire mais non selon les critères Bonnes Pratiques de Laboratoire (GLP)

Type of assay:

comet assay

Test material

Test material information

Constituent 1

Reference substance name:

aluminium(3+) ion tris(propan-2-olate)

Cas Number:

555-31-7

Molecular formula:

C₉H₂₁AlO₃

IUPAC Name:

aluminium(3+) ion tris(propan-2-olate)

Specific details on test material used for the study:

non spécifié

Method

Target gene:

non applicable

Species / strain

Species / strain / cell type:

other: CD4+T cells

Details on mammalian cell type (if applicable):

Des lymphocytes T CD4 + humains ont été obtenus à partir d'une lignée cellulaire Jurkat de lymphome T auxiliaire de l'American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA).

Additional strain / cell type characteristics:

not specified

Metabolic activation:

without

Test concentrations with justification for top dose:

0, 50, 100, 500, 1000 and 5000 μM AlCl3.

Vehicle / solvent:

non spécifié

Controls

Untreated negative controls:

yes

Negative solvent / vehicle controls:

not specified

True negative controls:

no

Positive controls:

other: différents sels testés

Details on test system and experimental conditions:

Traitement de culture cellulaire et conditions:
Les cellules étaient des cultures dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM, GIBCO, Carlsbad, CA) additionné de 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Hyclone Laboratories, Logan, UT) à 37 ° C dans une atmosphère composée de 0,5% de C02. Après qu'ils sont devenus confluents (tous les 3 à 4 jours), les cultures ont été sous-cultivées. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans des plaques à 24 puits contenant du milieu frais et les solutions d'essai.

Préparation de solutions d'essai:
Aucune information.

Administration de solutions de test:
Volume: NR; L'exposition s'est produite dans des plaques de puits.

Durée de l'exposition, calendrier / durée des incubations:
Les cellules ont été soumises à une exposition à des solutions métalliques pendant 48 heures.

Vérification analytique des niveaux de dose:
Pas effectué.

Incubations par dose / point de temps:
Cela n'a pas été indiqué pour le test Comet. Les tests d'apoptose et de viabilité ont été réalisés en triple et la mesure de la prolifération en quadruple.

Mesure des résultats de l'étude:
Neutral Comet Assay
Le test de la comète (Trevigen, Gaithersburg, MD) a été utilisé. Les auteurs rapportent les protocoles du fabricant suivants. Les lymphocytes T Jurkat métallisés ont été coulés dans de l'agarose fondu (37 ºC) sur des lames de verre (1 x 10E5 cellules / mL à 1:10), lysés et déroulés en utilisant des solutions alcalines (pH> 13). Les gels ont ensuite subi une électrophorèse (10 min à 22 mV). Une coloration (colorant de gel d'acide nucléique SYBR Green I) a été ajoutée pour montrer les queues fluorescentes des fragments d'ADN qui avaient migré. La quantité de dommages à l'ADN a été mesurée par la longueur de la queue de la comète et normalisée par rapport aux témoins non traités pour donner un indice de dommage à l'ADN (IDD).

50 cellules différentes provenant de deux lames séparées à chaque concentration ont été examinées pour chaque métal et les images ont été analysées en utilisant un programme d'analyse d'images accessible au public pour le test Comet.

Evaluation criteria:

Neutral Comet Assay
La longueur de la queue de la comète a été utilisée comme indice de lésion de l'ADN et normalisée à la valeur du témoin non traité. Un IDD (indice de dommage à l'ADN)> 75 était considéré comme un niveau élevé («significatif») de dommage à l'ADN. Un IDD <75 mais> 0 était un dommage modéré et un IDD = 0 était défini comme un dommage à l'ADN faible.

Apoptose (cytométrie de flux / caspase-9)
Apoptose "significative": ≥ 50% de cellules caspase-9 positives.

Dommage significatif à la viabilité ou à la «toxicité»:
> 50% de cellules positives à l'iodure de propidium.

Inhibition de la prolifération [absorption de 3H-thymidine]:
P <0,05 comparant les comptes de cellules traitées par métal par minute avec le témoin non traité.

Statistics:

Test t de Student et un niveau de signification de p <0,05.

Results and discussion

Test results

Key result

Species / strain:

other: CD4+T cells

Metabolic activation:

without

Genotoxicity:

negative

Cytotoxicity / choice of top concentrations:

no cytotoxicity

Vehicle controls validity:

valid

Untreated negative controls validity:

not examined

Positive controls validity:

not specified

Additional information on results:

- cytotoxicité
La viabilité cellulaire a été déterminée en utilisant la coloration à l'iodure de propidium (PI) et dans un cytomètre de flux FACScan (Becton Dickinson Co.). La viabilité / toxicité générale pour les différents traitements métalliques a été classée à l'aide d'un indice CL50 (concentration létale). % des cellules étaient viables). Ces tests ont été menés en triple exemplaire.

- apoptose
Pour chaque métal, environ 1 x 106 cellules ont été incubées pendant 48 heures dans une plaque de culture à 24 puits dans 1 ml de milieu. Dix microlitres d'un inhibiteur de pan-caspase conjugué au FITC (ApoStat) ont été ajoutés au cours des 30 dernières minutes. Les cellules ont été colorées, récoltées, lavées deux fois avec du PBS et remises en suspension dans 400 μL de tampon pour la cytométrie en flux afin de quantifier l'activité intracellulaire de la caspase-9 (cytomètre en flux FACScan - Becton Dickinson Co., San Diego, CA). débris cellulaire. Tous les tests ont été réalisés en triple.

- essais de prolifération
- incorporation de [3H] -thymidine
Des essais de prolifération quadruple ont été réalisés pendant 6 jours en utilisant des plaques de culture à 96 puits (Sigma), avec une densité d'environ 0,2 x 10E6 cellules / puits pendant 6 jours dans 150 ul / puits de milieu complet (DMEM, 10% FBS). La température était de 37 ºC et l'atmosphère contenait 0,5% de CO2. De la [3H] -thymidine (1 mCi / puits) a été ajoutée durant les 12 dernières heures de la période de culture de 6 jours et un récolteur de cellules a été utilisé pour collecter les CD4 + T membranes cellulaires Jurkat lymphocytaires. Un compteur de plaques bêta a été utilisé pour mesurer l'incorporation de [3H] -thymidine.

Any other information on results incl. tables

Point (s) de terminaison principal (s):

Neutral Comet Assay

Des effets génotoxiques significatifs n'ont été observés à aucune des concentrations testées (50 à 5000 μM-Al).

Apoptose (cytométrie de flux / caspase-9)

Une apoptose significative a été observée seulement à la plus forte concentration testée (5000 μM-Al)

 

Dommage significatif à la viabilité ou à la «toxicité»:

Une toxicité significative n'a été observée à aucune des concentrations testées (50 à 5000 μM-Al).

 

Inhibition de la prolifération [absorption de 3H-thymidine]:

Une inhibition significative de la prolifération n'a été observée à aucune des concentrations testées (50 à 5000 μM-Al).

Autres sels:

Concentrations de chlorure de métal (μM) auxquelles des effets nocifs importants (tels que définis dans l'article) ont été observés:

Metal	DNA damage	Apoptosis (Caspase-9)	Viability (PI)	Prolife-ration Inhibition
V	50	50	1000	50
Ni	50	100	5000	500
Co	5000	5000	500	100
Cu	>5000	500	5000	100
Nb	>5000	500	500	>5000
Mo	>5000	1000	>5000	500
Zr	5000	500	5000	>5000
Be	>5000	5000	1000	5000
Cr	>5000	>5000	>5000	>5000
Al	>5000	5000	>5000	>5000
Fe	>5000	5000	>5000	>5000

Applicant's summary and conclusion

Conclusions:

Le traitement à l'aluminium n'a pas entraîné d'augmentations significatives des cassures double brin d'ADN (test Comet neutre)
En outre, aucune inhibition de la croissance cellulaire (capture de 3H-thymidine), effets sur la viabilité (colorant PI qui colore l'ADN nucléaire) n'a été observée à n'importe quelle concentration appliquée. Un effet apoptotique significatif déterminé par la mesure de l'activité intracellulaire de la caspase-9 a été observé seulement à la concentration la plus élevée d'AlCl3 utilisée (5000 μM-Al).

Des effets génotoxiques significatifs ont été observés sur le vanadium, le nickel et le cobalt. En se basant sur les dommages à l'ADN, l'apoptose et les effets sur la viabilité et la prolfération, les auteurs ont classé les sels de chlorure de métaux comme suit: V> Ni> Co> Cu> Nb> Mo> Zr> Be> Cr> Al> Fe.

Executive summary:

Caicedo et al.(2008) ont examiné les lésions de l'ADN dans des cellules T humaines (Jurkat) à des concentrations de AlCl3 (50, 100, 500, 1000 et 5000 μM-Al) en utilisant le test Comet neutre.

Le déroulement et l'électrophorèse de l'ADN à pH neutre détectent moins de types de dommages à l'ADN que l'utilisation du pH> 13. Le test neutre détecte principalement les cassures à double brin. Un effet significatif sur les dommages à l'ADN a été défini comme un indice de dommage à l'ADN (basé sur la longueur relative de la queue de la comète)> 75. L'aluminium n'a pas entraîné d'augmentations significatives des cassures d'ADN double brin.Dans l'ensemble, l'étude semblait suivre un protocole standard et les résultats étaient négatifs.

Dans la publication, la viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant la coloration à l'iodure de propidium, la prolifération cellulaire en utilisant l'absorption de 3H-thymidine et l'apoptose en utilisant l'immunocoloration de la caspase-9 et la cytométrie de flux.

Plus de 50% des cellules positives à la caspase ont été considérées comme une apoptose significative et > 50% des cellules positives à l'iodure de propidium comme un effet significatif sur la viabilité ou un effet significatif sur la viabilité à toute concentration appliquée.L'apoptose était significative seulement à 5000 μM-Al. Les cellules utilisées dans cette étude n'ont pas été largement utilisées avec ce test.

Si la valeur p du test t de Student était inférieure à 0,05 dans la comparaison des comptes par minute dans les cellules traitées aux métaux par rapport aux témoins non traités, l'inhibition de la prolifération basée sur l'absorption de 3H-thymidine était considérée comme significative.